NANOLAB  3D Gel™即用型 3D細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠

產(chǎn)品介紹：

即用型 3D 細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠

產(chǎn)品描述和規(guī)格

3D Gel™ 為無動物源性多糖水凝膠體系，模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 環(huán)境。水凝膠為即用型中性 pH 溶液，室溫即可穩(wěn)定保存。使用時(shí)，只需與細(xì)

胞培養(yǎng)基混合即可形成水凝膠基質(zhì)。水凝膠顏色透明，具有可滲透性，相容 于多種細(xì)胞成像系統(tǒng)。培養(yǎng)在水凝膠系統(tǒng)的細(xì)胞可在試驗(yàn)后輕松收獲，水凝 膠也可注射，非常適合體內(nèi)研究。3D Gel 為細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)具功能性且優(yōu) 化的環(huán)境，讓細(xì)胞感覺在家一樣。從 2D 凝膠培養(yǎng)，3D 細(xì)胞培養(yǎng)到動物注射， 3D Gel 提供一個(gè)可以同時(shí)適用于體外研究與活體實(shí)驗(yàn)的共通操作平臺。 TheWell 有兩種水凝膠系統(tǒng)：

3D Gel – 適用于懸浮細(xì)胞系

3D Gel-RGD（RGD 肽修飾的 3D Gel）– 適用于貼壁細(xì)胞

應(yīng)用說明：

產(chǎn)品：          3D Gel (Cat#: NANO001)

                3DGel-RGD (Cat#: NANO002)

僅供科研用途，不得用于診斷過程。

3D細(xì)胞培養(yǎng)

（可注射水凝膠制備）

材料：

3D Gel，細(xì)胞培養(yǎng)基，微量移液器或注射器，細(xì)胞培養(yǎng)孔板，細(xì)胞， 37 ?C 水浴

方法：

1.     在 37?C 預(yù)熱 3D Gel 溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基。

2. 向 4mL 3D Gel 溶液中加入 1mL 細(xì)胞懸液，使用微量移液器（或 快速渦旋振蕩）輕輕混勻，盡量不要產(chǎn)生氣泡。（對于水凝膠注射：混合 物可轉(zhuǎn)移到注射器，水凝膠在穩(wěn)定 15-30 分鐘后即可用于注射。）

3.     將水凝膠混合液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)孔板。

注：傾斜/旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以確保水凝膠在培養(yǎng)板上包被均勻。

不同細(xì)胞板的推薦體積如下表：

4.     等待 15 分鐘至水凝膠穩(wěn)定。

5.     小心加入細(xì)胞培養(yǎng)基以覆蓋水凝膠溶液。

6.    將細(xì)胞培養(yǎng)板加入培養(yǎng)箱，每 48 小時(shí)換液

注：

l       預(yù)熱 3D Gel 溶液有助于降低溶液粘度。

l       終細(xì)胞濃度可根據(jù)不同細(xì)胞類型調(diào)整。我們推薦 2×105 to 1×106。

2D 凝膠培養(yǎng)                                                                                                              

材料：

3D Gel，細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS，微量移液器，細(xì)胞培養(yǎng)孔板，細(xì)胞，37 ?C 水浴

方法：

1.     在 37 ?C 預(yù)熱 3D Gel 溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.     向 4mL VitroGel  3D 溶液中加入 1mL 細(xì)胞培養(yǎng)基(或 PBS)，使用微量 移液器（或快速渦旋振蕩）輕輕混勻，盡量不要產(chǎn)生氣泡。

3.     將水凝膠混合液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)孔板。

注：傾斜/旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以確保水凝膠在培養(yǎng)板上包被均勻。

4.     等待 15 分鐘至水凝膠穩(wěn)定。

5.     吸出多余液體，小心將細(xì)胞加到水凝膠頂部。

6.     將細(xì)胞培養(yǎng)板加入培養(yǎng)箱，每 48 小時(shí)換液。

注：

l       預(yù)熱 3D Gel 溶液有助于降低溶液粘度。

l       終細(xì)胞濃度可根據(jù)不同細(xì)胞類型調(diào)整。

NANOLAB  3D Gel™即用型 3D細(xì)胞培養(yǎng)水凝膠

初次使用說明

（請?jiān)谑褂卯a(chǎn)品前仔細(xì)閱讀）

請根據(jù)不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)基組分優(yōu)化 VitroGel  3D 水凝膠系統(tǒng)，以得到更

好的結(jié)果。初次使用用戶，強(qiáng)烈建議培養(yǎng)不同的細(xì)胞系時(shí)，都進(jìn)行水凝膠濃 度梯度測試。

請參照以下步驟設(shè)置水凝膠濃度梯度：

1.     稀釋：可通過稀釋水凝膠溶液調(diào)節(jié)終水凝膠強(qiáng)度：直接將水凝膠溶液 與去離子水或 0.1X PBS（不含鈣或鎂離子）以 1:0-1:5（水凝膠溶液： 去離子水，v/v）室溫混合。（終膠強(qiáng)度 1:0 > 1:1 > 1:2 > 1:3 > 1:4 > 1:5）

2.     成膠：稀釋的水凝膠溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基不同的混合比例會影響成膠速度 及終的膠強(qiáng)度。推薦的混合比例為 4:1-1:3（稀釋的水凝膠：細(xì)胞培養(yǎng) 基，  v/v）。

l       相同稀釋度的水凝膠溶液，添加越多細(xì)胞培養(yǎng)基，成膠越快。 對于稀釋度較高的水凝膠溶液（eg. 1:3, 1:4 or 1:5），請使用較多 的細(xì)胞培養(yǎng)液混合，以確保水凝膠在合理的時(shí)間內(nèi)成膠。

l       不同細(xì)胞培養(yǎng)基的推薦混合比例，請參考下表。

活/死細(xì)胞分析                                                                                        

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞，活/死細(xì)胞染色液，PBS，微量移液器， 熒光顯微鏡

方法：

1.     移去覆蓋于水凝膠之上的細(xì)胞培養(yǎng)基，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

2.     用 PBS 制備 5X 活/死細(xì)胞染色溶液

3.     將活/死細(xì)胞染色溶液直接加入到水凝膠中并淹沒整個(gè)凝膠。推薦體積如 下表：

4.     在黑暗中孵育 5 分鐘，在熒光顯微鏡下觀察。

注：

l    推薦使用 5X 染色液作為起始濃度?？苫诓煌?xì)胞系和成像系統(tǒng)優(yōu)化 更佳濃度。

l    細(xì)胞染色后應(yīng)盡快分析

細(xì)胞收獲：

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞，0.1XPBS 或去離子水，離心管，微量移

液器，37?C 水浴，漩渦震蕩儀

方法：(使用 24 孔板，250μL 膠/孔為例)

1.     在 37℃水浴預(yù)熱 0.1X PBS(或去離子水)及空的離心管。

2.     由培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄掉覆蓋于水凝膠頂部的培養(yǎng)基。

3.     每孔加入 1 mL 預(yù)熱的 0.1X PBS，并上下吹打以*混勻。

4.     將混合物加入預(yù)熱的離心管。

5.     用 1 mL 預(yù)熱的 0.1X PBS 潤洗每個(gè)孔，并加入離心管中。

6.     上下吹打，充分混勻，并加入預(yù)熱的 0.1X PBS 至 10mL。

7.     將離心管漩渦震蕩 5-10 秒，并在 37℃水浴放置 1-5 分鐘（可選）。

8.     1,000 rpm 離心 2-5 分鐘，棄上清，收集細(xì)胞沉淀。

9.     用預(yù)熱的 0.1X PBS 重懸細(xì)胞，如果需要可重復(fù) 6-8 步驟一次(可選)。

注：

l       使用預(yù)熱的 0.1X  PBS 或去離子水，不要使用冷的溶液或 1X PBS（或 高離子濃度的細(xì)胞培養(yǎng)基）。

l       根據(jù)不同細(xì)胞系優(yōu)化離心的速度和時(shí)間。

熒光染色：

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞，PBS，微量移液器，固定液（4％甲醛 PBS 溶液），滲透液（0.1% Triton X-100 PBS 溶液），肌動蛋白抑制劑染色液，細(xì) 胞核染色液，微量移液管，熒光顯微鏡。

方法：

1.     移去覆蓋于水凝膠之上的細(xì)胞培養(yǎng)基，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

2.     將固定液加入水凝膠中，并在室溫孵育 30 分鐘。

3.     棄去固定液，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

4.     加入滲透液并淹沒整個(gè)凝膠，置于室溫 5 分鐘。

5.     棄去滲透液，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

6.     加入肌動蛋白抑制劑染色液，室溫，黑暗孵育 1 小時(shí)。

7.   棄去肌動蛋白抑制劑染色液，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

8.     加入細(xì)胞核染色液，室溫，黑暗孵育 5 分鐘。

9.     棄去細(xì)胞核染色液， 并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

10.   熒光顯微鏡下觀察。

注：

l       根據(jù)產(chǎn)品使用說明配制染色液?？筛鶕?jù)不同細(xì)胞系和水凝膠調(diào)節(jié)染色液 終濃度。

l       在清洗步驟中，小心添加或移除溶液，以避免損失水凝膠/細(xì)胞。

l       孵育時(shí)間可根據(jù)不同細(xì)胞系調(diào)整。

l       水凝膠加入染色液后，應(yīng)避免光照。

l       確保 PBS 沖洗步驟*，同時(shí)水凝膠在整個(gè)過程中都需要溶液覆蓋。

組織學(xué)分析：

材料：

培養(yǎng)于 3D Gel 系統(tǒng)中的細(xì)胞，PBS，卡夾，石蠟，二甲苯，固定液（10％ 福爾馬林），乙醇（50-100％）

方法：

1.     移去覆蓋于水凝膠之上的細(xì)胞培養(yǎng)基，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次

2.     將固定液加入水凝膠中，并在室溫孵育 30 分鐘。

3.     棄去固定液，并用 PBS 沖洗水凝膠 3 次。

4.     將水凝膠放于卡夾中，用乙醇，按照以下順序脫水：

50％（10 分鐘） - 70％（10 分鐘） - 80％（10 分鐘） - 95％（10 分鐘） - 100％（10 分鐘） - 100％（10 分鐘） - 100％（10  分鐘）。

5.     將乙醇換為二甲苯，按照以下順序脫水：

65％乙醇：35％二甲苯（10-15 分鐘）-50％乙醇+50％二甲苯（10-15 分鐘）- 35％乙醇+65％二甲苯（10-15 分鐘） - 100％二甲苯（10-15 分鐘） - 100％二甲苯（10-15 分鐘） - 100％二甲苯（10 分鐘）

6.     將二甲苯換為石蠟，按照以下順序：

65％二甲苯+35％石蠟(30  分鐘)  -  50％二甲苯+50％石蠟(30 分鐘) -

35％二甲苯+65％石蠟(30 分鐘) - 100% 石蠟 (1-2 小時(shí)) - 100% 石 蠟(1-2 小時(shí)或過夜)

7.     嵌入新鮮的石蠟中后，切片，放于顯微鏡載玻片上。

8.     根據(jù)不同的應(yīng)用進(jìn)行染色和組裝。

注：

l    根據(jù)不同細(xì)胞系和水凝膠大小優(yōu)化孵育時(shí)間。確保水凝膠在整個(gè)過程中 都被溶液覆蓋。

表 B：不同細(xì)胞的推薦稀釋比例和混合比例